FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit 用戶指南

FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit 用戶指南

——高效、低樣本量DNA文庫構建解決(jue) 方案

一、產品概述

FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit（貨號：FC-121-4003）是一款專(zhuan) 為(wei) Illumina高通量測序平台設計的DNA文庫構建試劑盒，適用於(yu) 低起始量DNA樣本（100 ng）的高效建庫。該試劑盒基於(yu) 磁珠純化技術，通過優(you) 化PCR擴增和片段選擇流程，顯著降低文庫偏差（bias）和覆蓋度缺口（coverage gaps），為(wei) 全基因組重測序、靶向測序及表觀遺傳(chuan) 學研究提供高質量數據支持。

核心參數：

• 規格：96樣本/板（96 indexes in plate format）

• 適用樣本類型：基因組DNA（gDNA）

• 起始量：100 ng（350 bp插入片段）或200 ng（550 bp插入片段）

• 文庫構建時間：<1天（手動操作）

• 兼容讀長：2×101 bp至2×151 bp

• 儲(chu) 存條件：-15℃至-25℃避光保存

二、技術優勢

1. 低樣本量兼容性

• 微量DNA輸入：僅(jin) 需100 ng起始量，適用於(yu) 腫瘤組織、FFPE樣本等珍貴樣本的建庫。

• 樣本保護：減少DNA消耗，保留樣本用於(yu) 後續分析。

2. 高覆蓋度與(yu) 低偏差

• 磁珠純化替代凝膠回收：避免傳(chuan) 統凝膠電泳導致的樣本損失，提升回收率。

• 優(you) 化PCR擴增：減少PCR誘導的覆蓋度缺口，GC富集區、啟動子及重複序列的覆蓋度顯著提升。

3. 高通量支持

• 96樣本並行處理：96孔板格式設計，適配自動化平台（如Biomek i7），單次運行可處理96個(ge) 樣本。

• 靈活索引配置：提供96種索引，避免樣本混淆。

4. 快速工作流程

• 簡化操作：預混試劑減少移液步驟，降低操作誤差。

• 單日建庫：從(cong) DNA片段化到文庫富集，全流程可在1天內(nei) 完成。

三、操作指南

（一）實驗前準備

1. 試劑與(yu) 耗材

• FC-121-4003 TruSeq Nano DNA HT Library Preparation Kit

• 96孔PCR板、磁力架、移液器（10-1000 μL）、Qubit熒光定量儀(yi)

• 超聲波打斷儀(yi) （如Covaris）、AMPure XP磁珠

2. 樣本準備

• DNA質量評估：使用Qubit或PicoGreen定量，A260/A280比值≥1.8。

• 片段化：將DNA片段化至350 bp或550 bp（推薦Covaris超聲波打斷）。

（二）實驗操作

1. 末端修複與(yu) 加A尾

• 將片段化DNA與(yu) 末端修複酶混合，37℃孵育30分鍾，72℃孵育30分鍾。

• 加入dATP和Taq酶，72℃孵育30分鍾，完成加A尾。

2. 接頭連接

• 添加預混的接頭（Adapters）和連接酶，20℃孵育15分鍾。

3. 磁珠純化

• 使用AMPure XP磁珠回收連接產(chan) 物，去除未結合的接頭。

4. PCR擴增

• 98℃ 30秒

• 98℃ 10秒 → 60℃ 30秒 → 72℃ 30秒（循環數：8-12）

• 72℃ 5分鍾

• 配置PCR反應體(ti) 係（含Index Primer），按以下程序擴增：

5. 文庫富集與(yu) 質量控製

• 再次使用磁珠純化PCR產(chan) 物，Qubit定量並使用Agilent Bioanalyzer或TapeStation檢測片段分布。

（三）實驗後處理

• 文庫混合：將等量文庫混合後，使用KAPA Library Quantification Kit定量。

• 上機測序：稀釋至4 nM，與(yu) PhiX質控DNA混合後上機（建議比例：5% PhiX）。

四、使用技巧與高效操作

1. 優(you) 化DNA片段化

• 片段大小：350 bp（Duty Factor 10%，Peak Incident Power 175，Cycles/Burst 200，Time 60秒）

• 片段大小：550 bp（Duty Factor 10%，Peak Incident Power 175，Cycles/Burst 200，Time 120秒）

• 使用Covaris ME220超聲波打斷儀(yi) ，參數建議：

2. 提高文庫質量

• 磁珠純化時，確保DNA與(yu) 磁珠比例（推薦1:0.8），避免過度清洗導致DNA損失。

• PCR循環數根據起始量調整（100 ng DNA建議10-12個(ge) 循環）。

3. 質量控製要點

• Qubit定量：確保文庫濃度≥2 nM。

• Bioanalyzer分析：主峰應在目標片段大小±20 bp範圍內(nei) ，無接頭二聚體(ti) 峰。

五、注意事項

1. 安全規範

• 操作時佩戴手套與(yu) 護目鏡，避免試劑接觸皮膚或吸入。

• 廢棄物需按化學危險品處理。

2. 操作細節

• 移液精度：使用校準後的移液器，誤差<±1%。

• 溫度控製：確保試劑和文庫在規定溫度下儲(chu) 存和處理。

3. 故障排除

• 文庫濃度低：檢查PCR循環數是否過低或磁珠純化效率。

• 片段分布異常：調整片段化參數或延長磁珠純化時間。

六、用戶評價與支持

• 用戶反饋：

• “FC-121-4003試劑盒顯著降低了FFPE樣本的建庫失敗率，數據質量穩定。"

• “磁珠純化流程簡單高效，適合高通量樣本處理。"