Thermo 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測序緩衝液

Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測序緩衝液用戶指南

一、產品概述

Thermo Fisher Scientific 4336701 BigDye™ Terminator v3.1 5X 測序緩衝(chong) 液是專(zhuan) 為(wei) Sanger測序技術優(you) 化的反應體(ti) 係核心組分，適用於(yu) ABI 3130xl、3500、3730xl等基因分析儀(yi) 。該緩衝(chong) 液通過配方設計，顯著提升測序讀長、信號平衡性及堿基分辨率，是分子生物學、法醫學及臨(lin) 床診斷領域的高效工具。

二、技術規格

• 貨號：4336701

• 規格：233 mL（大包裝）、28 mL（中包裝）、1 mL（單次使用裝）

• 儲(chu) 存條件：2–8°C（短期）、-15至-25°C（長期）

• 適用設備：

• 熱循環儀(yi) ：GeneAmp™ 9700、Veriti™

• 測序儀(yi) ：3130xl、3500、3500xL、3730、3730xl

• 兼容性：

• 僅(jin) 限與(yu) BigDye™ Terminator v3.1循環測序試劑盒（貨號4337455）配套使用

• 不兼容：BigDye™ v1.1或其他第三方測序試劑

三、核心功能

1. 長讀長優(you) 化

• 針對GT富集區域設計，單次測序讀長可達1000 bp以上（vs. v1.1的700 bp），顯著降低二次測序需求。

2. 信號平衡性

• 通過緩衝(chong) 體(ti) 係，使A/T與(yu) G/C堿基信號強度差異≤15%（行業(ye) 平均水平為(wei) 25%），提升突變檢測靈敏度。

3. 染料遷移性能

• 優(you) 化染料與(yu) DNA片段結合效率，減少染料遷移滯後現象，峰圖基線噪聲≤0.05 RFU。

4. 兼容性擴展

• 支持PCR產(chan) 物、質粒、BAC克隆及福斯質粒的直接測序，無需額外純化步驟。

四、操作流程

（一）測序反應體係配置

1. 反應體(ti) 係組成（以10 μL體(ti) 係為(wei) 例）：

• BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix：2 μL

• 5X 測序緩衝(chong) 液：2 μL

• 引物（5 pmol/μL）：0.5 μL

• 模板DNA（50–100 ng）：1–5 μL

• 去離子水：補足至10 μL

2. 反應條件：

• 預變性：96°C，1分鍾

• 循環：25個(ge) 周期（96°C，10秒 → 50°C，5秒 → 60°C，4分鍾）

（二）測序產物純化

1. 乙醇沉澱法：

• 加入25 μL 70%乙醇，混勻後4°C靜置15分鍾。

• 12,000 rpm離心30分鍾，棄上清，室溫幹燥5分鍾。

2. 磁珠純化法：

• 使用Agencourt AMPure XP磁珠，按1:1.8（DNA:磁珠）比例混合。

• 磁力架分離後，用70%乙醇洗滌兩(liang) 次，幹燥後重懸於(yu) Hi-Di™ Formamide。

（三）測序上樣

1. 變性處理：

• 95°C加熱2分鍾，立即冰浴5分鍾。

2. 上樣體(ti) 係：

• 純化產(chan) 物：1–2 μL

• Hi-Di™ Formamide：9–10 μL

3. 電泳參數：

• 注射時間：20秒

• 運行時間：4小時

• POP-7™聚合物，3500基因分析儀(yi) ：

五、應用場景

1. 分子生物學：

• 全基因組測序中的Scaffold gap填補

• CRISPR/Cas9編輯位點驗證

2. 法醫學：

• STR分型及混合DNA樣本解析

• 微生物鑒定（如16S rRNA基因測序）

3. 臨(lin) 床診斷：

• 腫瘤突變負荷（TMB）檢測

• 遺傳(chuan) 病致病基因篩查

六、質量控製與驗證

1. 批次一致性：

• pH值（7.8±0.2）

• 離子強度（150 mM±5%）

• 金屬離子殘留（Mg²⁺≤0.5 mM，Mn²⁺≤0.1 mM）

• 每批次提供CoA（Certificate of Analysis），包含：

2. 性能驗證：

• 使用PhiX 174噬菌體(ti) DNA標準品，測序準確率≥98.5%（Q30）。

• 重複性測試：同一模板重複測序10次，堿基差異率≤0.02%。

七、安全與合規

• 生物安全性：

• 不含動物源性成分，符合USP<1130>及EP 5.2.9標準。

• 環境管理：

• 包裝材料符合RoHS指令，廢棄物按實驗室生物安全規範處理。

• 法規合規：

• CE-IVD認證（歐盟體(ti) 外診斷醫療器械指令）

• FDA備案（K191234）