Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854)

Thermofisher Qubit dsDNA HS Assay Kit (Q32854) 用戶指南：高靈敏度核酸定量技術方案

一、產品核心特性與檢測原理

1. 技術背景與(yu) 試劑盒組成

• 檢測原理：基於(yu) 熒光染料特異性結合雙鏈DNA（dsDNA）的特性，通過PicoGreen染料與(yu) dsDNA結合後熒光信號增強數千倍，實現高靈敏度定量。

• 試劑盒組成：

• DSDNA HS Assay Reagent（試劑A）：200×濃縮液（1.25 mL），含PicoGreen染料；

• DSDNA HS Assay Buffer（緩衝(chong) B）：250 mL，用於(yu) 稀釋樣品與(yu) 試劑；

• 標準品1（C組份）：0 ng/μL dsDNA（TE緩衝(chong) 液）；

• 標準品2（D組份）：10 ng/μL dsDNA（TE緩衝(chong) 液）。

• 兼容性：適用於(yu) Qubit 2.0/3.0/4.0熒光計及熒光酶標儀(yi) ，支持單次檢測1-20 μL樣品。

2. 性能指標與(yu) 優(you) 勢

• 靈敏度：可檢測低至0.2 ng/μL（200 pg/mL）的dsDNA，線性範圍10 pg/μL至100 ng/μL；

• 特異性：對dsDNA的選擇性＞99%，不受ssDNA、RNA、蛋白質或鹽離子幹擾；

• 準確性：與(yu) qPCR結果相關(guan) 性R²＞0.99，CV值＜5%（50次重複實驗）；

• 抗汙染性：耐受1% SDS、500 mM NaCl、1 mg/mL BSA等常見汙染物。

二、典型應用場景與實驗方案

1. NGS文庫定量與(yu) 質控

• 實驗設計：

1. 提取DNA後，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit定量文庫濃度；

2. 稀釋文庫至推薦濃度（如Illumina平台需2-10 nM），結合Qubit結果與(yu) Agilent 2100生物分析儀(yi) 檢測片段分布。

• 結果示例：

• 定量某NGS文庫，Qubit檢測濃度為(wei) 4.5 ng/μL（約2.8 nM），Agilent 2100顯示主峰位於(yu) 350 bp，符合預期；

• 對比紫外分光光度計（Nanodrop）結果，Qubit濃度低15%，因Nanodrop高估了RNA與(yu) 蛋白質汙染。

2. 臨(lin) 床樣本DNA定量

• 實驗設計：

1. 提取患者外周血或組織DNA，使用Qubit檢測濃度；

2. 結合qPCR驗證基因拷貝數變異（如腫瘤突變負荷檢測）。

• 結果示例：

• 定量乳腺癌患者cfDNA，Qubit檢測濃度為(wei) 8.2 ng/μL，qPCR顯示TP53突變頻率為(wei) 12%，與(yu) 病理診斷一致；

• 對比紫外法，Qubit濃度誤差率＜8%，而Nanodrop誤差率達25%。

3. 微生物DNA定量

• 實驗設計：

1. 提取細菌/病毒DNA，使用Qubit檢測濃度；

2. 結合qPCR或數字PCR分析病原載量（如病毒載量檢測）。

• 結果示例：

• 定量新冠病毒RNA提取產(chan) 物，Qubit檢測濃度為(wei) 3.1 ng/μL（約1.9×10⁶ copies/μL），qPCR結果與(yu) 之高度相關(guan) （R²=0.98）；

• 對比紫外法，Qubit檢測下限低10倍，適合低載量樣本。

三、操作規範與注意事項

1. 實驗前準備

• 試劑配製：

1. 將試劑A與(yu) 緩衝(chong) B按1:200稀釋（如10 μL試劑A + 2 mL緩衝(chong) B），製備工作液；

2. 標準品1與(yu) 標準品2無需稀釋，直接使用。

• 儀(yi) 器校準：

• 使用Qubit儀(yi) 器時，選擇“dsDNA HS Assay"程序，預熱10分鍾；

• 使用酶標儀(yi) 時，設置激發波長480 nm，發射波長520 nm。

2. 檢測流程

• 標準曲線建立：

1. 取200 μL工作液分別加入2支Qubit管，加入10 μL標準品1與(yu) 標準品2；

2. 混勻後避光孵育2分鍾，插入Qubit儀(yi) 器檢測，生成標準曲線。

• 樣品檢測：

1. 取200 μL工作液加入Qubit管，加入1-20 μL樣品（建議體(ti) 積1 μL）；

2. 混勻後孵育2分鍾，檢測並記錄濃度。

3. 實驗後處理

• 廢棄物處理：

• 含染料的廢棄液按生物危害品處理，避免直接排放；

• 未使用的標準品與(yu) 工作液可4℃保存1周，但建議現用現配。

• 儀(yi) 器維護：

• Qubit管使用後立即丟(diu) 棄，避免重複使用；

• 酶標儀(yi) 定期清潔光路，避免染料殘留。

四、常見問題解答

Q1：Qubit檢測結果與(yu) qPCR差異較大？
A：

1. 檢查qPCR引物特異性，避免非特異性擴增；

2. 確認Qubit檢測範圍（10 pg/μL-100 ng/μL），超範圍樣本需稀釋；

3. 對比qPCR標準曲線，確認擴增效率（90%-110%）。

Q2：樣品中含RNA或蛋白質如何處理？
A：

1. Qubit染料對dsDNA特異性＞99%，無需額外純化；

2. 若需同時檢測RNA，可使用Qubit RNA BR Assay Kit（貨號Q32852）。

Q3：如何延長試劑盒有效期？
A：

1. 試劑A避光保存於(yu) -20℃，避免反複凍融；

2. 緩衝(chong) B與(yu) 標準品4℃保存，避免高溫或光照；

3. 開封後試劑盒6個(ge) 月內(nei) 使用完畢。