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SYBR Green I 熒光染料：SYBR Green I 能夠與(yu) 雙鏈 DNA 結合，在遊離狀態下，SYBR Green I 幾乎沒有熒光信號；當它與(yu) 雙鏈 DNA 結合後，熒光信號會(hui) 顯著增強。隨著 PCR 反應中雙鏈 DNA 的不斷合成，與(yu) SYBR Green I 結合的量也逐漸增加，熒光信號強度與(yu) PCR 產(chan) 物的數量呈正相關(guan) ，通過實時監測熒光信號強度，即可反映出目標核酸的擴增情況，從(cong) 而實現對病毒核酸的定量分析。
TaqMan 探針：TaqMan 探針是一段與(yu) 目標核酸序列互補的寡核苷酸，其 5' 端標記有報告熒光基團，3' 端標記有淬滅熒光基團。在 PCR 反應過程中，當引物延伸至探針結合位點時，Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性會(hui) 將探針降解，使報告熒光基團與(yu) 淬滅熒光基團分離，報告熒光基團發出的熒光信號不再被淬滅，從(cong) 而產(chan) 生可檢測的熒光信號。熒光信號強度同樣與(yu) PCR 產(chan) 物的數量相關(guan) ，以此實現對目標核酸的定量檢測。
高靈敏度：能夠檢測到極低濃度的病毒核酸，可檢測到低至幾個(ge) 拷貝的病毒 RNA 或 DNA，有助於(yu) 早期病毒感染的診斷和研究，即使在病毒感染初期病毒載量較低時，也能準確檢測到病毒核酸的存在。
高特異性：試劑盒中包含的特異性引物和探針，經過精心設計和優(you) 化，能夠與(yu) 目標病毒核酸序列特異性結合，有效避免與(yu) 其他非目標核酸序列的交叉反應，確保檢測結果的準確性，減少假陽性結果的出現。
寬檢測範圍：可在較寬的濃度範圍內(nei) 對病毒核酸進行準確定量，無論是低病毒載量樣品還是高病毒載量樣品，都能實現可靠的檢測和定量分析，滿足不同研究和檢測場景的需求。
操作簡便：試劑盒提供了完整的試劑和詳細的操作說明，實驗流程標準化，無需複雜的操作步驟和特殊的儀(yi) 器設備，科研人員隻需按照說明書(shu) 進行操作，即可完成從(cong) 樣本處理到結果分析的整個(ge) 過程，大大提高了實驗效率。
穩定性好：各試劑組分經過嚴(yan) 格的質量控製和穩定性測試，在推薦的儲(chu) 存條件下，能夠保持良好的性能，確保不同批次的試劑盒檢測結果具有較高的一致性和重複性，為(wei) 科研和臨(lin) 床檢測提供可靠的保障。
兼容性強：適用於(yu) 多種樣本類型，包括血清、血漿、組織勻漿、拭子提取物等，同時兼容不同品牌和型號的實時熒光定量 PCR 儀(yi) ，方便科研人員根據自身實驗室條件進行選擇和使用。
試劑檢查：收到試劑盒後，檢查試劑盒包裝是否完好，確認各試劑組分是否齊全，包括反轉錄試劑、PCR 反應預混液、特異性引物、ROX 染料、陽性對照、陰性對照等。查看試劑的有效期，確保在有效期內(nei) 使用。將試劑盒短暫離心（低速，如 2000 - 3000 rpm，離心 1 - 2 分鍾），使附著在管蓋上的試劑集中於(yu) 管底。
樣本準備：
樣本采集：根據實驗目的和樣本類型，采用合適的方法進行樣本采集。如采集血清或血漿樣本時，需嚴(yan) 格按照無菌操作規範進行靜脈采血，分離血清或血漿；采集組織樣本時，使用無菌器械獲取組織，並迅速放入液氮或 - 80℃冰箱中保存，避免樣本降解。
樣本處理：對於(yu) 不同類型的樣本，需要進行相應的核酸提取處理。可使用 Qiagen 或其他品牌的核酸提取試劑盒，按照說明書(shu) 的操作步驟提取病毒核酸。提取後的核酸樣本需進行濃度和純度測定，可采用超微量紫外分光光度計或熒光定量法進行檢測，確保核酸質量符合實驗要求。
儀(yi) 器準備：準備好實時熒光定量 PCR 儀(yi) ，確保儀(yi) 器運行正常，按照儀(yi) 器操作手冊(ce) 進行預熱和校準。根據實驗需求，選擇合適的反應板和封板膜，將反應板放置在 PCR 儀(yi) 的樣品槽中。
反轉錄反應（適用於(yu) RNA 病毒檢測）：
配製反應體(ti) 係：在無菌的 PCR 管中，按照以下比例配製反轉錄反應體(ti) 係（以 20 μL 體(ti) 係為(wei) 例）：
5×QuantiTect Reverse Transcription Buffer：4 μL
QuantiTect Reverse Transcriptase Mix：1 μL
RNase - free Water：補至 14 μL
模板 RNA：適量（根據樣本核酸濃度調整，一般為(wei) 1 - 10 μL）
混合均勻：用移液器輕輕吹打或振蕩 PCR 管，使反應體(ti) 係充分混合均勻，短暫離心（2000 - 3000 rpm，1 - 2 分鍾），使反應液集中於(yu) 管底。
反應條件：將 PCR 管放入 PCR 儀(yi) 中，設置反轉錄反應條件：42℃孵育 30 分鍾（進行反轉錄反應），95℃孵育 15 分鍾（滅活反轉錄酶）。反應結束後，將 cDNA 產(chan) 物置於(yu) 冰上或 - 20℃冰箱中保存備用。
實時熒光定量 PCR 反應：
配製反應體(ti) 係：在無菌的 PCR 管或反應板孔中，按照以下比例配製 PCR 反應體(ti) 係（以 20 μL 體(ti) 係為(wei) 例）：
2×QuantiTect PCR Master Mix：10 μL
ROX Reference Dye（根據 PCR 儀(yi) 型號選擇合適濃度）：1 μL
上遊引物（10 μM）：0.5 μL
下遊引物（10 μM）：0.5 μL
cDNA 模板或 DNA 模板：適量（根據反轉錄產(chan) 物或樣本核酸濃度調整，一般為(wei) 1 - 5 μL）
RNase - free Water：補至 20 μL
混合均勻：用移液器輕輕吹打或振蕩反應管或反應板，使反應體(ti) 係充分混合均勻，短暫離心（2000 - 3000 rpm，1 - 2 分鍾），使反應液集中於(yu) 管底。
封板：如果使用反應板，需使用封板膜將反應板密封，確保密封良好，防止反應過程中液體(ti) 蒸發。
反應條件：將反應管或反應板放入實時熒光定量 PCR 儀(yi) 中，設置 PCR 反應條件：
預變性：95℃，15 分鍾（激活熱穩定 DNA 聚合酶，使模板 DNA 變性）
循環反應：94℃，15 秒（變性）；55 - 60℃，30 秒（退火，根據引物的 Tm 值調整）；72℃，30 秒（延伸），進行 40 - 45 個(ge) 循環
熔解曲線分析（可選，用於(yu) 檢測 PCR 產(chan) 物的特異性）：95℃，15 秒；60℃，1 分鍾；95℃，15 秒
啟動反應：確認 PCR 儀(yi) 的參數設置無誤後，啟動 PCR 反應。在反應過程中，實時熒光定量 PCR 儀(yi) 會(hui) 實時監測熒光信號強度，並記錄數據。
數據查看：PCR 反應結束後，使用實時熒光定量 PCR 儀(yi) 配套的數據分析軟件查看實驗數據。軟件會(hui) 自動生成擴增曲線和熔解曲線（如果進行了熔解曲線分析），通過觀察擴增曲線的形狀和 Ct 值（循環閾值，即熒光信號達到設定閾值時的循環數），判斷樣本中病毒核酸的含量。
定量計算：根據標準曲線法或相對定量法進行病毒核酸的定量計算。
標準曲線法：使用已知濃度的病毒核酸標準品（如試劑盒提供的陽性對照或自行製備的標準品），進行梯度稀釋後，按照上述實驗操作步驟進行 PCR 反應，繪製標準曲線（Ct 值與(yu) 標準品濃度的對數呈線性關(guan) 係）。根據樣本的 Ct 值，在標準曲線上查找對應的核酸濃度，從(cong) 而實現對樣本中病毒核酸的定量分析。
相對定量法：如果隻需要比較不同樣本之間病毒核酸的相對表達量，可采用相對定量法。選擇一個(ge) 內(nei) 參基因（如 β - actin、GAPDH 等），同時對樣本中的內(nei) 參基因和目標病毒核酸進行 PCR 反應，通過計算目標基因與(yu) 內(nei) 參基因的 Ct 值差值（ΔCt），以及不同樣本之間的 ΔΔCt 值，來分析目標病毒核酸在不同樣本中的相對表達變化。
結果報告：根據實驗數據和分析結果，撰寫(xie) 實驗報告，詳細記錄實驗目的、實驗方法、實驗結果（包括樣本 Ct 值、病毒核酸濃度、定量分析結果等）以及實驗結論。確保實驗結果的準確性和可靠性，如有異常結果，需進行進一步的分析和驗證。
試劑保存：實驗結束後，將剩餘(yu) 的試劑按照要求保存於(yu) - 20℃冰箱中，避免反複凍融。對於(yu) 已開封的試劑，需盡快使用，並在使用前檢查試劑是否有變質或汙染的跡象。
廢棄物處理：實驗過程中產(chan) 生的廢棄物，如含有樣本、試劑的液體(ti) 以及使用過的耗材等，應按照實驗室生物安全和化學廢棄物處理規定進行分類處理。對於(yu) 含毒核酸的樣本和試劑，需進行高壓滅菌或化學消毒處理後，再進行丟(diu) 棄，防止病毒傳(chuan) 播和環境汙染。
試劑使用：
嚴(yan) 格按照說明書(shu) 要求的儲(chu) 存條件保存試劑，避免試劑因儲(chu) 存不當而失效。
使用前將試劑從(cong) 冰箱中取出，置於(yu) 室溫下解凍，並充分混勻，但要避免劇烈振蕩，防止產(chan) 生氣泡。
試劑使用過程中，應使用無菌的移液器和吸頭，避免交叉汙染。每次取試劑後，及時將試劑管蓋緊，放回冰箱保存。
樣本處理：
樣本采集和處理過程中，需嚴(yan) 格遵守無菌操作規範，防止樣本被外源核酸汙染，導致假陽性結果。
對於(yu) 高致病性病毒樣本，需在生物安全實驗室中按照相應的生物安全等級進行操作，確保操作人員的安全。
樣本核酸提取過程中，要注意操作的準確性和穩定性，確保提取的核酸質量符合實驗要求。提取後的核酸樣本應盡快進行檢測，如需保存，可置於(yu) - 80℃冰箱中，但避免多次凍融。
儀(yi) 器操作：
實時熒光定量 PCR 儀(yi) 需定期進行校準和維護，確保儀(yi) 器的性能穩定和檢測結果的準確性。
在使用 PCR 儀(yi) 前，檢查儀(yi) 器的運行狀態，確保儀(yi) 器的溫度、熒光檢測等功能正常。
反應板和封板膜需與(yu) PCR 儀(yi) 兼容，封板時要確保密封良好，防止反應過程中液體(ti) 蒸發和汙染。
實驗設計：
在進行實驗前，需合理設計實驗方案，設置足夠的重複樣本和對照樣本（如陽性對照、陰性對照、空白對照等），以確保實驗結果的可靠性和可重複性。
對於(yu) 不同類型的病毒和樣本，需根據其特點和實驗需求，選擇合適的引物和探針，並進行預實驗，優(you) 化實驗條件。
安全防護：實驗過程中使用的試劑和樣本可能具有一定的生物危害性或化學毒性，操作人員需佩戴手套、口罩、護目鏡等防護裝備，在通風櫥中進行操作。如不慎接觸到試劑或樣本，應立即用大量清水衝(chong) 洗，並根據情況進行相應的處理。
無擴增曲線：
原因：可能是引物或探針設計不合理、引物或探針濃度過低、模板核酸質量不佳、反應體(ti) 係中存在抑製劑、PCR 反應條件不合適等。
解決(jue) 方法：重新設計引物或探針，確保其特異性和有效性；適當提高引物或探針的濃度；重新提取樣本核酸，確保核酸質量；檢查反應體(ti) 係中是否存在抑製劑，如樣本中可能含有蛋白質、多糖等物質，可通過純化核酸或稀釋樣本進行處理；優(you) 化 PCR 反應條件，如調整退火溫度、延伸時間等。
擴增曲線異常（如曲線斜率低、平台期不明顯等）：
原因：可能是模板核酸濃度過高或過低、引物或探針濃度不合適、dNTPs 濃度不足、熱穩定 DNA 聚合酶活性下降、PCR 反應循環數設置不合理等。
解決(jue) 方法：對模板核酸進行梯度稀釋，選擇合適的濃度進行實驗；調整引物或探針濃度；檢查 dNTPs 濃度，確保其充足；更換熱穩定 DNA 聚合酶；根據實驗需求，合理調整 PCR 反應循環數。
Ct 值偏大：
原因：可能是模板核酸濃度過低、引物或探針效率低、PCR 反應條件不合適、反應體(ti) 係中存在抑製劑等。
解決(jue) 方法：增加模板核酸的上樣量；優(you) 化引物或探針設計，提高其擴增效率；調整 PCR 反應條件，如提高退火溫度、延長延伸時間等；對樣本進行純化處理，去除抑製劑。
假陽性結果：
原因：可能是實驗過程中發生交叉汙染、引物或探針特異性差、陽性對照濃度過高、PCR 反應條件過於(yu) 寬鬆等。
解決(jue) 方法：加強實驗操作的規範性，使用帶濾芯的吸頭，避免交叉汙染；重新設計引物或探針，提高其特異性；降低陽性對照的濃度；優(you) 化 PCR 反應條件，提高反應的嚴(yan) 謹性。
熔解曲線出現多個(ge) 峰：
原因：可能是引物二聚體(ti) 形成、非特異性擴增、模板核酸不純等。
解決(jue) 方法：降低引物濃度，優(you) 化引物設計，減少引物二聚體(ti) 的形成；調整 PCR 反應條件，提高反應的特異性；對模板核酸進行進一步純化處理，去除雜質。
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