使用高容量cDNA逆轉錄試劑盒進行基因表達分析的實驗步驟

樣本收集與(yu) 保存：根據實驗目的收集合適的生物樣本，如細胞、組織或體(ti) 液等。收集後，立即將樣本置於(yu) RNA 保護劑中，或液氮速凍後轉移至 - 80°C 冰箱保存，防止 RNA 降解。

RNA 提取：使用合適的 RNA 提取試劑盒，如 TRIzol 試劑、矽膠膜柱式提取試劑盒等，按照說明書(shu) 操作從(cong) 樣本中提取總 RNA。提取過程中注意避免 RNA 酶汙染，使用無 RNA 酶的耗材和試劑，操作在冰上進行以減少 RNA 降解。

RNA 質量檢測：通過分光光度計測定 RNA 濃度和純度，A260/A280 比值應在 1.8 - 2.0 之間，A260/A230 比值應大於(yu) 2.0，比值偏離範圍表明可能存在蛋白質、酚類或鹽類汙染。同時，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性，觀察 28S 和 18S rRNA 條帶是否清晰、亮度比例是否約為(wei) 2:1，若條帶彌散則提示 RNA 降解。

試劑準備：從(cong) 低溫冰箱取出高容量 cDNA 逆轉錄試劑盒，置於(yu) 冰上解凍。準備無 RNA 酶的 PCR 管、移液槍及槍頭。

反應體(ti) 係配製：在 PCR 管中依次加入以下試劑（以 20μl 反應體(ti) 係為(wei) 例）：2μg 總 RNA、1μl 隨機引物或 1μl oligo (dT) 引物（根據樣本類型選擇）、4μl 5×RT Buffer、1μl 10mM dNTP Mix、1μl RNase Inhibitor、1μl Reverse Transcriptase，最後用無 RNA 酶水補足至 20μl。輕輕混勻，短暫離心使反應成分集中於(yu) 管底。

逆轉錄反應程序：將 PCR 管放入 PCR 儀(yi) ，設置反應程序：25°C 孵育 10 分鍾（引物退火）；37°C 孵育 120 分鍾（逆轉錄反應）；70°C 孵育 15 分鍾（酶失活）。反應結束後，cDNA 產(chan) 物可立即用於(yu) 後續實驗，或保存於(yu) - 20°C 備用。

引物設計：根據目的基因序列，使用專(zhuan) 業(ye) 引物設計軟件（如 Primer Premier、NCBI Primer - BLAST）設計特異性引物，引物長度一般為(wei) 18 - 25bp，Tm 值在 58 - 62°C 之間，GC 含量 40 - 60%。同時設計內(nei) 參基因（如 β - actin、GAPDH）引物，用於(yu) 數據歸一化。

反應體(ti) 係配製：在 PCR 管中依次加入：10μl 2×qPCR Master Mix、0.5μl 上遊引物（10μM）、0.5μl 下遊引物（10μM）、1μl cDNA 模板，用無 RNase 水補足至 20μl。輕輕混勻，短暫離心。

qPCR 反應程序：將 PCR 管放入實時熒光定量 PCR 儀(yi) ，設置反應程序：95°C 預變性 3 分鍾；95°C 變性 15 秒，60°C 退火 / 延伸 30 秒，共 40 個(ge) 循環。反應結束後，分析擴增曲線和熔解曲線，確保擴增特異性。

數據分析：采用 2-ΔΔCt 法計算目的基因相對表達量。首先計算每個(ge) 樣本目的基因與(yu) 內(nei) 參基因 Ct 值的差值（ΔCt），再計算實驗組與(yu) 對照組 ΔCt 的差值（ΔΔCt），最後根據公式 2-ΔΔCt 得出目的基因相對表達倍數。

實時熒光定量 PCR（qPCR）：

基因芯片分析：將逆轉錄合成的 cDNA 進行標記（如采用熒光染料標記），標記後的 cDNA 與(yu) 基因芯片上的探針進行雜交，經過洗滌、掃描等步驟，獲取基因芯片圖像。使用專(zhuan) 業(ye) 軟件分析圖像數據，得到每個(ge) 基因的熒光信號強度，通過標準化處理後，分析基因表達差異，篩選出上調或下調基因。

轉錄組測序（RNA - seq）：將 cDNA 構建測序文庫，利用高通量測序技術進行測序。測序數據經過質量控製、比對到參考基因組或轉錄組、定量分析等步驟，得到基因表達譜。通過差異表達分析、富集分析等生物信息學方法，深入研究基因表達變化及其功能意義(yi) 。