有哪些方法可以提高SDS-PAGE凝膠電泳的分辨率？

凝膠製備優化

• 選擇合適的凝膠濃度：根據目標蛋白質分子量範圍選擇最佳凝膠濃度。小分子蛋白質（<20>100 kDa）則選用 7%-10% 的低濃度凝膠。對於(yu) 分子量範圍較寬的樣品，可使用梯度凝膠（如 4%-20%）實現更廣泛的分離。

• 確保凝膠聚合質量：控製聚合溫度在 20-25℃，避免溫度波動影響凝膠孔徑均一性。過硫酸銨（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）的添加量要精確，過量會(hui) 導致凝膠脆化，不足則聚合。建議新鮮配製 APS 溶液，並在 1 周內(nei) 使用。

電泳條件優化

• 降低電泳溫度：高溫會(hui) 導致蛋白質擴散加劇，條帶變寬。可采用以下措施降溫：在冰浴中進行電泳、使用循環冷卻水係統或降低電泳電壓延長電泳時間。例如，將電壓從(cong) 200V 降至 100V，雖然電泳時間延長，但條帶更清晰。

• 優(you) 化緩衝(chong) 液係統：使用 Tris - 甘氨酸緩衝(chong) 液時，確保 pH 值在 8.3 左右。定期更換電泳緩衝(chong) 液，長時間使用會(hui) 導致離子強度變化，影響分辨率。對於(yu) 高分辨率需求，可考慮使用 MOPS 或 MES 緩衝(chong) 係統，尤其適用於(yu) 小分子蛋白質分離。

樣品處理改進

• 精確控製上樣量：過量上樣會(hui) 導致條帶拖尾和重疊。一般每孔上樣量為(wei) 10-20μg 總蛋白，對於(yu) 純化的蛋白質樣品，5-10μg 即可。使用微量移液器確保上樣量準確，並避免樣品溢出至相鄰孔。

• 優(you) 化樣品煮沸時間：樣品與(yu) 上樣緩衝(chong) 液混合後，煮沸時間控製在 5-10 分鍾。過長時間煮沸可能導致蛋白質聚集，影響分離效果。對於(yu) 含二硫鍵較多的蛋白質，可適當延長煮沸時間至 10 分鍾。

儀器與耗材選擇

• 使用高質量的預製膠：預製膠的凝膠濃度和聚合條件經過嚴(yan) 格控製，重複性好，可減少因手工製膠導致的分辨率差異。選擇信譽良好的品牌，確保凝膠質量穩定。

• 清潔電泳設備：電泳槽和梳子使用後需清洗，殘留的 SDS 和蛋白質會(hui) 幹擾後續實驗。可先用 0.1% SDS 溶液浸泡，再用蒸餾水衝(chong) 洗幹淨，晾幹備用。

特殊技術應用

• 使用梯度凝膠：梯度凝膠的孔徑從(cong) 頂部到底部逐漸減小，能夠在同一凝膠上分離不同分子量範圍的蛋白質，提高分辨率。尤其適用於(yu) 複雜蛋白質樣品的分離。

• 采用雙向電泳：結合等電聚焦和 SDS-PAGE 的雙向電泳技術，可將上千種蛋白質在二維平麵上分離，顯著提高分辨率和蛋白質檢測靈敏度。