SDS-PAGE 一步法凝膠快速製備試劑盒操作流程詳解

一、實驗前準備與試劑預混

1. 試劑解凍與平衡

   從(cong) - 20℃冰箱取出試劑盒中的預製膠母液（含分離膠與(yu) 濃縮膠預混液）、催化劑（如過硫酸銨溶液、TEMED）及電極緩衝(chong) 液，室溫放置 10-15 分鍾至解凍。

• 確保所有試劑無沉澱或分層，若出現輕微渾濁，可輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩產(chan) 生氣泡。

2. 器材預處理

• 組裝垂直電泳槽（如 Mini-PROTEAN® 係統），用 75% 乙醇擦拭玻璃板內(nei) 側(ce) ，去除油汙與(yu) 雜質，晾幹後安裝密封夾，確保玻璃板邊緣無滲漏。

二、凝膠製備與灌注

1. 一步法膠液配製

• 根據實驗需求（如分離膠濃度：常用 8%-15%），按試劑盒說明書(shu) 比例取預製膠母液。例如，製備 10% 分離膠時，取 5 mL 母液加入 0.1 mL 催化劑 A（過硫酸銨）和 5 μL 催化劑 B（TEMED），立即用移液器吹打 3-5 次混勻（動作需迅速，避免膠液提前凝固）。

2. 垂直灌注分離膠

• 用 10 mL 注射器吸取混合膠液，從(cong) 玻璃板間隙底部緩慢注入，至距離梳子底部約 1.5 cm 處停止（預留濃縮膠空間）。

• 立即在膠液表麵覆蓋一層約 500 μL 的正丁醇或水飽和異丁醇，液麵需平整，以隔絕空氣並促進膠麵凝固（約 15-20 分鍾）。

3. 製備濃縮膠

• 倒去覆蓋液，用濾紙吸幹膠麵殘餘(yu) 液體(ti) ，取濃縮膠預混液（通常 4% 濃度）2 mL，加入 0.05 mL 催化劑 A 和 2 μL 催化劑 B，混勻後注入分離膠上方，至玻璃板頂端。

• 插入配套梳子，避免氣泡殘留，室溫靜置 10-15 分鍾至凝固。

三、樣品處理與上樣

1. 蛋白樣品製備

• 取細胞、組織或純化蛋白樣品，按 1:1 比例加入試劑盒提供的 2×SDS 上樣緩衝(chong) 液（含 β- 巰基乙醇、溴酚藍），100℃沸水浴煮 5 分鍾，使蛋白充分變性並解離為(wei) 亞(ya) 基。

• 12000 rpm 離心 5 分鍾，取上清備用（避免沉澱堵塞加樣孔）。

2. 上樣操作

• 小心拔出梳子，用 1× 電極緩衝(chong) 液衝(chong) 洗加樣孔，去除未凝固的膠塊與(yu) 雜質。

• 用微量進樣器按順序加入樣品（每孔 10-20 μL），同時加入預染蛋白 Marker（如 10-170 kDa）作為(wei) 分子量參照，注意避免交叉汙染。

四、電泳與凝膠檢測

1. 電泳參數設置

• 向電泳槽上下槽加入 1× 電極緩衝(chong) 液（確保上槽液覆蓋加樣孔），連接電源，初始電壓設置為(wei) 80 V，待溴酚藍前沿進入分離膠後，調至 120 V 恒壓電泳（約 40-60 分鍾，具體(ti) 時間取決(jue) 於(yu) 膠濃度與(yu) 蛋白大小）。

2. 終止電泳與凝膠回收

• 當溴酚藍前沿接近膠底部時，關(guan) 閉電源，拆卸電泳槽，用刀片小心撬開玻璃板，凝膠應牢固附著於(yu) 其中一塊板上。

• 若需染色，可直接進行考馬斯亮藍染色（試劑盒或自備染色液），或轉膜用於(yu) Western blot（按常規流程操作）。

五、注意事項與關鍵控製點

• 催化劑用量精確性：過硫酸銨與(yu) TEMED 的添加量需嚴(yan) 格按說明書(shu) 執行，過量會(hui) 導致凝膠脆性增加，不足則凝固。

• 溫度控製：凝膠凝固速度受溫度影響（25℃時最佳），低溫環境可適當延長靜置時間，避免頻繁移動電泳槽。

• 氣泡排除：灌注膠液時需保持注射器垂直，速度均勻，若出現氣泡，可用針頭小心挑破或重新灌注。

• 樣品兼容性：高鹽或高濃度去汙劑樣品需預先透析或稀釋，避免影響電泳分辨率。

六、流程對比與效率優勢