Western及IP裂解液的使用方法及注意事項

一、Western 及 IP 裂解液的使用方法

1. 實驗前準備

• 樣本收集：根據實驗需求收集細胞或組織樣本。對於(yu) 細胞樣本，貼壁細胞需先用 PBS 緩衝(chong) 液輕柔洗滌 2 - 3 次，去除培養(yang) 基殘留；懸浮細胞則通過離心（通常 500 - 1000 rpm，3 - 5 分鍾）收集，並用 PBS 重懸洗滌。組織樣本需在預冷的生理鹽水中清洗，去除血液等雜質，並用幹淨的剪刀或刀片將其剪碎成小塊。

• 裂解液準備：從(cong) 低溫儲(chu) 存環境（-20℃或 4℃，根據產(chan) 品說明）取出裂解液，平衡至室溫。若裂解液中蛋白酶抑製劑、磷酸酶抑製劑等為(wei) 單獨包裝，需在使用前按照說明準確添加到裂解液中，並充分混勻。

2. 樣本裂解

• 細胞樣本裂解：對於(yu) 貼壁細胞，可直接在培養(yang) 板中加入適量裂解液（通常每 1×10⁶個(ge) 細胞加入 100 - 200 μL 裂解液），輕輕搖晃培養(yang) 板使裂解液均勻覆蓋細胞表麵，然後置於(yu) 冰上，通過溫和振蕩（如渦旋振蕩器，低速振蕩 1 - 2 分鍾）或超聲處理（30 秒超聲，間隔 30 秒，重複 3 - 5 次，超聲功率需根據細胞類型調整）進行裂解。懸浮細胞則需先離心去除 PBS，再加入裂解液，同樣在冰上進行振蕩或超聲處理。

• 組織樣本裂解：將剪碎的組織樣本轉移至預冷的勻漿器或離心管中，按照每 100 mg 組織加入 500 - 1000 μL 裂解液的比例添加裂解液。先使用機械勻漿器進行初步勻漿，使組織破碎，然後結合超聲處理進一步裂解細胞，確保蛋白質充分釋放。

3. 蛋白質提取

• 靜置與(yu) 離心：樣本裂解完成後，將其置於(yu) 冰上靜置 5 - 10 分鍾，使裂解更充分。隨後，將裂解物轉移至離心管中，在 4℃條件下，以 12000 - 15000 rpm 離心 10 - 15 分鍾，使細胞碎片、不溶性物質沉澱於(yu) 管底，而上清液即為(wei) 含有蛋白質的裂解產(chan) 物。

• 收集上清：小心吸取上清液至新的離心管中，避免吸入沉澱。若後續實驗對蛋白質濃度要求較高，可對上清液進行適當濃縮處理，如使用超濾管進行濃縮。

二、使用 Western 及 IP 裂解液的注意事項

1. 裂解液儲(chu) 存與(yu) 保質期

• 儲(chu) 存條件：裂解液應嚴(yan) 格按照產(chan) 品說明進行儲(chu) 存，多數需在 - 20℃低溫保存，避免反複凍融，因為(wei) 多次凍融可能導致蛋白酶抑製劑等成分失活，影響裂解效果。若裂解液含有對溫度敏感的特殊成分，可能需要在 4℃保存。

• 保質期檢查：使用前需檢查裂解液的保質期，過期的裂解液可能因成分降解而無法有效裂解細胞或保護蛋白質，從(cong) 而影響實驗結果。若裂解液出現渾濁、沉澱或顏色異常等情況，應避免使用。

2. 操作過程中的細節把控

• 低溫操作：整個(ge) 樣本裂解和處理過程應盡量在冰上或 4℃環境中進行，以降低細胞內(nei) 蛋白酶的活性，減少蛋白質的降解。特別是對於(yu) 一些不穩定或易降解的蛋白質，低溫操作尤為(wei) 重要。

• 避免交叉汙染：使用無菌的移液器槍頭、離心管等實驗器具，避免不同樣本之間的交叉汙染。同時，在添加裂解液、吸取上清等操作時，要小心謹慎，防止液體(ti) 濺出汙染其他樣本或實驗環境。

• 裂解條件優(you) 化：不同的細胞類型和組織樣本對裂解條件的要求可能不同，需根據實際情況優(you) 化裂解時間、超聲功率、振蕩強度等參數。例如，對於(yu) 一些細胞壁較厚的植物細胞或堅韌的組織樣本，可能需要適當延長裂解時間或提高超聲功率，但也要避免過度裂解導致蛋白質結構破壞。

3. 與(yu) 後續實驗的兼容性

• 成分兼容性：確保裂解液中的成分不會(hui) 對後續實驗產(chan) 生幹擾。例如，若後續要進行蛋白質純化（如親(qin) 和層析、離子交換層析），裂解液中的高濃度鹽、去垢劑等成分可能影響純化效果，需進行適當的透析、稀釋或更換緩衝(chong) 液等處理。若進行質譜分析，需注意裂解液中的某些添加劑可能會(hui) 影響質譜檢測，應選擇質譜兼容的裂解液或進行樣品預處理。

• 實驗體(ti) 係匹配：根據後續實驗目的選擇合適的裂解液。若進行 Western Blot 實驗，需保證裂解液能夠使蛋白質充分變性；若進行 IP 實驗，則要選擇能夠保持蛋白質天然構象的溫和型裂解液，以確保蛋白質 - 蛋白質相互作用不被破壞。