優化冷凍切片實驗質量的實用技巧與建議

若後續需進行 HE 染色、免疫組化，可采用 4% 多聚甲醛（PFA）室溫固定 15-30 分鍾（根據組織大小調整，如 1 cm³ 組織固定 20 分鍾），固定後用 PBS 衝(chong) 洗 3 次（每次 5 分鍾），去除殘留固定液，避免固定過度導致組織變硬、難切片；

若進行酶活性檢測、脂質染色，需避免固定，采用 “新鮮組織直接冷凍"，但需在 - 80℃液氮中快速速凍（＜5 分鍾），防止組織內(nei) 水分形成大冰晶（大冰晶會(hui) 破壞細胞結構，導致切片出現孔洞）。

對神經組織、軟骨等易脆組織，可在包埋前用 10%-20% 蔗糖溶液（溶於(yu) PBS）4℃浸泡 2-4 小時（組織沉底即可），蔗糖可滲透至細胞內(nei) ，降低組織冰點，減少冷凍過程中冰晶的形成，提升切片韌性。使用櫻花 SAKURA 高黏附型 OCT 包埋劑（貨號 4587）時，蔗糖處理後的組織黏附性可提升 20%，避免切片時組織與(yu) 包埋劑分離。

常規 HE 染色、組織形態觀察：選擇櫻花 SAKURA 常規型 OCT 包埋劑（貨號 4583），其低結晶配方可確保切片完整，性價(jia) 比高；

免疫熒光、熒光原位雜交（FISH）：必須選擇低熒光型 OCT 包埋劑（貨號 4585），避免包埋劑自身熒光幹擾目標信號，實驗前可通過熒光顯微鏡預檢測（激發波長 488 nm 下，熒光強度應＜50 RFU）；

脂肪、軟骨、骨骼等特殊組織：優(you) 先使用高黏附型 OCT 包埋劑（貨號 4587），其 APTES 黏附促進劑可增強組織與(yu) 包埋劑的結合力，切片完整率提升至 85% 以上。

包埋前 1 小時將 OCT 包埋劑放入 4℃冰箱預冷（無需冷凍，避免結晶），預冷後的包埋劑黏度更穩定，傾(qing) 倒時不易產(chan) 生氣泡；

向包埋模具（如櫻花 SAKURA 一次性包埋盒，貨號 T200）中加入包埋劑時，需沿模具壁緩慢傾(qing) 倒，若出現氣泡，可用移液器槍頭輕輕挑破，氣泡會(hui) 導致切片出現 “空白區"，影響觀察。

將處理好的組織放入包埋模具中央，確保組織四周均有 OCT 包埋劑包裹（包埋劑厚度≥2 mm），避免組織緊貼模具壁（模具壁冷凍速度快，易導致組織邊緣冷凍不均，切片時邊緣斷裂）。

對小組織（如直徑＜2 mm 的淋巴結），可先用少量包埋劑在模具底部鋪一層薄墊，再將組織放在墊上，防止組織下沉至模具底部，導致切片時無法完整獲取組織。

不建議將組織直接放入液氮中速凍（易導致組織表麵瞬間結冰，內(nei) 部水分無法及時排出，形成大冰晶），推薦 “梯度速凍法"：先將包埋模具放入 - 20℃冷凍切片機冷凍室預冷 10 分鍾，待包埋劑表麵凝固後，再轉移至 - 80℃冰箱冷凍 30 分鍾（或液氮上方 5 cm 處熏蒸 10 分鍾），使組織從(cong) 外到內(nei) 緩慢冷凍，冰晶直徑可控製在 5 μm 以下，避免細胞結構破壞。

柔軟組織（如腦組織、肝髒）：冷凍溫度控製在 - 18~-20℃，溫度過高易導致切片黏連在刀片上，溫度過低會(hui) 使組織變脆，切片斷裂；

堅硬組織（如皮膚、軟骨）：冷凍溫度需降至 - 22~-25℃，增強組織硬度，便於(yu) 切片，但需避免溫度過低（＜-30℃），否則組織會(hui) 出現 “崩裂"；

脂肪組織：因脂肪導熱性差，冷凍溫度需穩定在 - 20℃，且冷凍時間需延長至 1 小時以上，確保脂肪凝固，否則切片時脂肪細胞易破裂，出現油滴。

切片過程中，冷凍切片機的溫度會(hui) 因開門取放樣品、刀片摩擦產(chan) 熱出現波動（±2℃），需每隔 30 分鍾觀察溫度顯示，若波動超過 ±1℃，需暫停切片，待溫度穩定後再繼續。使用櫻花 SAKURA 低結晶 OCT 包埋劑時，即使溫度有輕微波動，也能減少結晶產(chan) 生，切片完整率保持在 90% 以上。

常規組織形態觀察（HE 染色）：切片厚度 5-8 μm，過薄易破碎，過厚會(hui) 導致細胞重疊，影響形態判讀；

免疫熒光實驗：切片厚度 3-5 μm，薄切片可減少抗體(ti) 滲透時間，降低非特異性染色，同時減少 OCT 包埋劑用量，降低熒光幹擾；

連續切片（如腦組織冠狀麵連續切片）：厚度控製在 5 μm，且需確保每片切片的厚度偏差＜0.5 μm（可通過冷凍切片機的厚度校準功能實現），避免因厚度不均導致後續拚接困難。

切片速度控製在 2-5 mm/s（根據組織硬度調整），柔軟組織需慢切（2 mm/s），避免組織拉伸變形；堅硬組織可稍快（5 mm/s），但需保持勻速，避免速度忽快忽慢導致切片出現 “波紋"。

切片時刀片需與(yu) 組織切麵呈 15°-20° 角（非垂直切割），角度過小易導致切片擠壓，角度過大易切斷組織，可通過調整冷凍切片機的刀片支架角度實現最佳切割角度。

常規軟組織（肝髒、腎髒）：選擇櫻花 SAKURA 高碳鋼刀片（貨號 S450），刀刃鋒利度高，可減少組織擠壓；

堅硬組織（皮膚、骨骼）：使用碳化鎢刀片（貨號 S600），耐磨性強，使用壽命是高碳鋼刀片的 3 倍，避免因刀片磨損導致切片出現刀痕；

免疫熒光實驗：優(you) 先選擇無熒光汙染的刀片（如櫻花 SAKURA 低熒光刀片），避免刀片表麵殘留的熒光物質幹擾實驗結果。

每切完一個(ge) 樣品後，需用無塵紙蘸取無水乙醇輕輕擦拭刀片表麵（從(cong) 刀刃向刀背方向擦拭，避免劃傷(shang) 刀刃），去除殘留的 OCT 包埋劑與(yu) 組織碎屑，防止交叉汙染；

當切片出現明顯刀痕、斷裂（排除組織與(yu) 溫度問題）時，需立即更換刀片，一般情況下，高碳鋼刀片每切 50-100 張切片需更換，碳化鎢刀片可切 300-500 張切片。

貼片前需將載玻片清洗幹淨（用洗潔精浸泡 30 分鍾，超聲清洗 10 分鍾，蒸餾水衝(chong) 洗 3 次，烘幹），對易脫落的組織切片（如皮膚、脂肪），可使用多聚賴氨酸包被載玻片（櫻花 SAKURA 多聚賴氨酸載玻片，貨號 M100），或在載玻片表麵塗抹少量 10% 明膠溶液（晾幹後使用），增強切片與(yu) 載玻片的結合力，避免後續染色時切片脫落。

貼片時將載玻片放在 37℃恒溫台上（溫度不宜過高，避免組織變性），用鑷子輕輕夾取切片，使其平整地鋪在載玻片中央，避免褶皺；

貼片後在 37℃恒溫台放置 15-20 分鍾（或室溫放置 30 分鍾），讓切片自然幹燥，幹燥過快會(hui) 導致切片收縮，幹燥過慢易滋生細菌，影響染色。

幹燥後的切片可直接放入 4% 多聚甲醛中固定 10 分鍾（或放入甲醇中固定 5 分鍾），固定過程中 OCT 包埋劑會(hui) 被固定液溶解，無需單獨脫包埋劑；

固定後用蒸餾水衝(chong) 洗 3 次（每次 3 分鍾），去除殘留的固定液與(yu) 溶解的 OCT 包埋劑，避免背景染色。

因 OCT 包埋劑含聚合物，需先用 PBS 衝(chong) 洗切片 5 分鍾（2 次），輕輕晃動容器，使包埋劑逐漸溶解；若包埋劑殘留較多，可在 PBS 中加入 0.1% Triton X-100（增強滲透性），室溫孵育 10 分鍾，再用 PBS 衝(chong) 洗幹淨；

脫包埋劑後需立即進行封閉（用 5% BSA 封閉 30 分鍾），避免組織抗原暴露時間過長導致降解，使用櫻花 SAKURA 低熒光 OCT 包埋劑時，脫包埋劑後的熒光背景可降低至 50 RFU 以下，無需額外處理。