親水作用色譜柱及其專用流動相在極性代謝物分析中的機理與應用

親(qin) 水作用色譜柱及其專(zhuan) 用流動相在極性代謝物分析中的機理與(yu) 應用

內(nei) 容簡介：
本文係統論述了親(qin) 水作用色譜（HILIC）作為(wei) 一種強極性化合物保留與(yu) 分離的有效策略，其保留機理、固定相分類以及方法開發要點。文章重點剖析了HILIC模式下水在固定相表麵形成富水層的作用，並詳細探討了流動相中有機溶劑比例、緩衝(chong) 鹽種類、濃度和pH值如何精密調控分析物的保留與(yu) 選擇性。針對極性代謝組學這一熱門應用領域，本文提供了從(cong) 樣品製備（需使用高乙腈含量的溶劑沉澱蛋白）、色譜柱選擇（酰胺基、二醇基、 zwitterionic 固定相）到質譜兼容流動相優(you) 化的完整解決(jue) 方案，旨在解決(jue) 強極性小分子在反相色譜上不保留或保留過弱的難題。

關(guan) 鍵詞： 親(qin) 水作用色譜（HILIC）、極性代謝物、保留機理、流動相優(you) 化、質譜兼容性

正文：

在代謝組學、 pharmaceuticals 雜質分析和食品安全檢測中，強極性和親(qin) 水性小分子（如氨基酸、核苷、糖類、有機酸、水溶性維生素）的分析始終是一個(ge) 挑戰。由於(yu) 它們(men) 在反相色譜（RPLC）固定相上保留極弱，通常在死時間附近被洗脫，無法與(yu) 基質中的其他成分有效分離。親(qin) 水作用色譜（Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC）的出現，為(wei) 這一難題提供了解決(jue) 方案。

一、 HILIC的保留機理：不止於(yu) 分配

HILIC的保留機理比RPLC更為(wei) 複雜，通常認為(wei) 是多種作用力的綜合結果：

1. 分配作用：這是最核心的機理。HILIC固定相表麵通常富含極性官能團（如酰胺、二醇、羧基等），流動相中的高比例水（通常>3%）會(hui) 吸附在固定相表麵，形成一個(ge) 富水的液層。分析物在流動相（高比例有機相，如乙腈）和這個(ge) 靜態水層之間進行分配。極性越強的化合物，其親(qin) 水性越強，越容易分配進入水層，因此保留時間越長。

2. 氫鍵作用：分析物與(yu) 固定相表麵的極性官能團形成氫鍵。

3. 偶極-偶極相互作用：分析物與(yu) 固定相之間的極性相互作用。

4. 離子交換作用：對於(yu) 某些固定相（如矽膠羥基、未封端的殘留矽羥基或zwitterionic固定相），如果分析物是離子化的，可能會(hui) 發生離子交換作用。這部分作用可以通過調節緩衝(chong) 鹽濃度和pH來調控。

二、 HILIC固定相的分類與(yu) 選擇

HILIC固定相的多樣性是其強大功能的體(ti) 現，主要分為(wei) ：

• 中性固定相：如酰胺基（-CONH₂）、二醇基（-CH(OH)-CH₂OH）。它們(men) 主要通過分配和氫鍵作用保留分析物，離子交換作用較弱，適用於(yu) 中性極性分子和弱離子化合物，峰形較好。

• 帶電固定相：

• 酸性固定相：如未封端的矽膠（表麵有酸性矽羥基）。在中性pH下帶負電，可通過陽離子交換作用保留帶正電的化合物。

• 堿性固定相：如氨基（-NH₂）柱。氨基在酸性條件下質子化帶正電，可通過陰離子交換作用保留帶負電的化合物。但氨基柱不穩定，易發生氧化或與(yu) 醛酮反應。

• 兩(liang) 性離子固定相（ZIC-HILIC）：同時含有磺酸基（帶負電）和季銨基（帶正電）。在很寬的pH範圍內(nei) 整體(ti) 呈電中性，主要通過強烈的分配作用保留化合物，離子交換作用最小化，能獲得非常對稱的峰形，尤其適合酸堿兩(liang) 性化合物（如氨基酸、神經遞質）。

三、 流動相優(you) 化：精密的平衡藝術

HILIC方法開發的核心是流動相的優(you) 化。

1. 有機相比例：通常起始有機相（乙腈）比例在80%-95%之間。增加有機相比例會(hui) 增強保留（這與(yu) RPLC相反），因為(wei) 促進了分析物向水層的分配。乙腈因其弱極性、高UV透過性和低粘度，是有機溶劑。

2. 緩衝(chong) 鹽與(yu) pH值：緩衝(chong) 鹽至關(guan) 重要，其作用包括：(a) 控製分析物的電離狀態；(b) 抑製固定相和分析物上的帶電基團之間的次級離子交換作用。常用濃度為(wei) 5-20 mM。甲酸銨/乙酸銨是質譜檢測，因其具有揮發性。pH值通過影響分析物和固定相的電離，對選擇性和保留時間有顯著影響。例如，在ZIC-HILIC柱上，降低pH會(hui) 使酸性化合物質子化（中性），保留減弱；而使堿性化合物離子化，保留增強（因與(yu) 固定相的靜電吸引）。

3. 水相中的水含量：水是HILIC中的強洗脫劑。增加水相比例會(hui) 減弱保留。

四、 在極性代謝組學中的完整工作流程

1. 樣品製備：采用冷乙腈或甲醇（通常樣本：乙腈=1:4）沉澱蛋白。上清液直接進樣，其高有機相組成與(yu) HILIC的初始流動相匹配，避免了溶劑效應，並實現了在線富集。

2. 色譜柱選擇：對於(yu) 全局極性代謝物分析，兩(liang) 性離子固定相（ZIC-HILIC）因其峰形和廣泛的適用性成為(wei)

3. 質譜兼容性：使用揮發性銨鹽緩衝(chong) 液，與(yu) 電噴霧離子源（ESI）MS/MS檢測無縫對接。HILIC模式下的高乙腈含量還能顯著提高ESI的離子化效率，進一步提升檢測靈敏度。

綜上所述，HILIC並非RPLC的替代，而是其強大的互補技術。通過理解其複雜機理並係統優(you) 化固定相和流動相，研究人員可以有效地駕馭HILIC，從(cong) 而揭開強極性代謝物的神秘麵紗，深入探索生命過程的化學本質。