337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 用戶指南

337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 用戶指南

——高效、靈敏的實時熒光定量PCR（qPCR）解決(jue) 方案

一、產品概述

337839 Qiagen qBiomarker SYBR Fluor Mastermix 是德國凱傑（QIAGEN）公司推出的高靈敏度實時熒光定量PCR預混液，專(zhuan) 為(wei) 基於(yu) SYBR Green染料的qPCR實驗設計。該產(chan) 品包含優(you) 化配方的反應緩衝(chong) 液、高保真HotStart DNA聚合酶、dNTPs及SYBR Green I染料，適用於(yu) 基因表達分析、SNP分型、病原體(ti) 檢測等應用場景。

核心參數：

• 貨號：337839

• 規格：25 mL（可滿足250次20 μL反應）

• 保存條件：-20℃避光保存，避免反複凍融

• 有效期：24個(ge) 月（未開封）

• 適用儀(yi) 器：兼容Bio-Rad、Applied Biosesystems、Eppendorf等主流qPCR儀(yi)

二、技術優勢

1. 高靈敏度與(yu) 特異性

• HotStart技術：化學修飾的DNA聚合酶在95℃高溫下激活，有效抑製非特異性擴增，減少引物二聚體(ti) 形成。

• SYBR Green I優(you) 化：染料與(yu) 雙鏈DNA結合效率高，熒光信號強，適用於(yu) 低豐(feng) 度模板的檢測（可檢測至單拷貝基因）。

2. 寬動態範圍與(yu) 高重複性

• 線性範圍：覆蓋7個(ge) 數量級（10¹–10⁷拷貝），適用於(yu) 絕對定量與(yu) 相對定量分析。

• 批間差異：CV值<5%（基於(yu) NIST標準品驗證），確保實驗結果可靠性。

3. 便捷性與(yu) 兼容性

• 即用型配方：無需額外添加MgCl₂、dNTPs或染料，簡化實驗流程。

• ROX校正選項：部分型號預混ROX染料，適用於(yu) 需要ROX校正的儀(yi) 器（如ABI 7500 Fast）。

三、操作指南

（一）實驗前準備

1. 試劑與(yu) 耗材

• qBiomarker SYBR Fluor Mastermix（貨號337839）

• 引物（終濃度100-900 nM，建議使用QIAGEN OligoPerfect Primer Design工具設計）

• cDNA模板（1-100 ng/反應，根據目標基因豐(feng) 度調整）

• 無核酸酶水（Nuclease-Free Water）

• 八聯管或96孔板（建議使用白色不透明板以減少熒光信號損失）

2. 儀(yi) 器設置

• 預變性：95℃ 5分鍾

• 40個(ge) 循環：95℃ 10秒 → 60℃ 30秒（退火溫度根據引物Tm值調整）

• 熔解曲線分析：60℃→95℃，每0.5℃采集一次熒光信號

• 溫度程序：

• 熒光通道：選擇SYBR Green通道（如ABI儀(yi) 器為(wei) FAM/SYBR通道）。

（二）實驗操作

1. 反應體(ti) 係配製（以20 μL體(ti) 係為(wei) 例）：

   
   

   成分	體積（μL）
   qBiomarker Mastermix	10
   正向引物（10 μM）	0.4
   反向引物（10 μM）	0.4
   cDNA模板	2
   無核酸酶水	7.2

   
   

2. 加樣與(yu) 離心

• 使用多通道移液器加樣，避免氣泡產(chan) 生。

• 離心（2000 × g，1分鍾）確保液體(ti) 沉至管底。

3. 上機運行

• 將八聯管或96孔板放入qPCR儀(yi) ，運行預設程序。

• 實時監測熒光信號，保存原始數據（Ct值、熔解曲線）。

（三）數據分析

1. Ct值判斷

• 推薦Ct值範圍：15-30（Ct>35需驗證擴增特異性）。

• 陰性對照（NTC）Ct值應無擴增（Ct>40或未檢測到）。

2. 熔解曲線分析

• 單一峰型（Tm值±0.5℃）表明特異性擴增。

• 多峰或肩峰提示引物二聚體(ti) 或非特異性擴增，需優(you) 化引物或反應條件。

3. 定量方法

• 絕對定量：使用標準曲線法，構建已知濃度模板的Ct值與(yu) 拷貝數關(guan) 係。

• 相對定量：采用2⁻ΔΔCt法，以內(nei) 參基因（如GAPDH）歸一化。

四、使用技巧與高效操作

1. 引物優(you) 化

• 使用QIAGEN OligoAnalyzer工具評估引物二聚體(ti) 形成風險。

• 梯度PCR確定最佳退火溫度（Tm±5℃）。

2. 模板質量控製

• 使用Nanodrop檢測RNA純度（OD260/280 1.9-2.1，OD260/230 >2.0）。

• 瓊脂糖凝膠電泳確認RNA完整性（真核生物應可見28S、18S、5S三條帶）。

3. 儀(yi) 器校準

• 定期使用NIST標準品驗證儀(yi) 器熒光檢測準確性。

• 確保ROX校正功能正常（如適用）。

五、注意事項

1. 安全規範

• 避免反複凍融，分裝後保存。

• 操作時佩戴手套，避免交叉汙染。

2. 操作細節

• 移液精度：使用校準後的移液器，誤差<±1%。

• 加樣順序：先加Mastermix，再加引物和模板，最後加無核酸酶水。

3. 故障排除

• 無擴增信號：檢查引物質量、模板濃度及反轉錄效率。

• Ct值偏大：優(you) 化退火溫度、延長延伸時間或提高模板投入量。

六、用戶評價與支持

• 用戶反饋：

• “qBiomarker Mastermix顯著降低了Ct值，提高了低豐(feng) 度基因的檢測靈敏度。"

• “熔解曲線分析功能幫助我們(men) 快速識別非特異性擴增，優(you) 化了實驗條件。"